人类扩张型心肌病发病机制新观点LMNA基

心肌病是心脏结构和功能异常的一类心脏疾病，扩张型心肌病（DilatedCardiomyopathy,DCM）是其中的一种，其特征在于左心室扩大、室壁变薄且收缩性差（图1），后期往往发展为心力衰竭，患者易发生心源性猝死。由于DCM的病因和发病机制尚不明确，目前并没有有效的治疗手段（CirculationResearch,）。据研究显示，至少40%～50%的DCM与遗传因素有关，现已发现30个基因与DCM的发病有关，其中A型核纤层蛋白基因（LMNA）是DCM的重要致病基因之一（心血管病学进展，）。

图1左图示正常心脏，右图示扩张型心肌病心脏（图片来自网络）。

核纤层（lamina）位于内层核膜的内表面，由A型与B型核纤层蛋白交织形成，在细胞核内的各种生物学过程中发挥着至关重要的作用，如染色质结构维持、DNA修复和基因表达调控。在真核生物基因组中，与核纤层接触的区域被定义为核纤层相关结构域（LaminaAssociatedDomain,LAD）（Cell,）。LAD分布在整个基因组中，参与基因组空间结构的调控、表观遗传调节因子的募集，从而参与基因的表达调控。与核纤层接触的基因，即位于LAD的基因通常表现为失活或低表达，且伴随抑制性的组蛋白翻译后修饰，如H3K9me2/3和H3K27me3；而脱离核纤层后通常伴随着基因的重新激活（Cells,）（图2）。

图2基因组区域与核纤层接触形成LAD后，该区域的基因表达受抑制；已形成的LAD脱离核纤层，该区域的基因重新激活表达。这个过程也伴随着表观遗传标记的改变（修改自Cells,）。

LMNA基因编码A型核纤层蛋白（包括核纤层蛋白A和核纤层蛋白C），是核纤层的组成成分。LMNA基因中不同位点的突变会导致不同种疾病，包括DCM、Emery-Dreifuss肌营养不良症（Emery-DreifussMuscularDystrophy,EDMD）、肢带型肌营养不良症（Limb-girdleMuscularDystrophy,LGMD）、脂肪营养不良（Lipodystrophies）和过早衰老（PrematureAging）等（图3），其中DCM最为凶险，常导致患者猝死（Circulation,）。

图3LMNA基因中不同位点的突变会导致不同疾病，多与肌肉相关（Annu.Rev.,）。

目前由LMNA基因突变引发DCM的分子机制尚不清楚，LMNA基因突变导致的信号通路（如丝裂原活化蛋白激酶通路）的变化、核骨架与细胞骨架连接体（LinkerofNucleoskeletonandCytoskeleton,LINC）的变化，及随后发生的机械传导的改变，都可能与DCM有关。LMNA基因编码的A型核纤层蛋白，是核纤层的组成成分。鉴于核纤层与基因组LAD区广泛接触并调控基因表达，DCM是否是由于LMNA基因突变引发LAD排布异常，进而导致基因表达失调造成的？

来自美国德克萨斯大学健康科学中心的Marian课题组研究发现，由LMNA基因突变导致的DCM（后简写为DCM）心肌细胞中LAD发生了异常排布，且与LAD的CpG甲基化和基因表达异常相关，相关论文发表在CirculationResearch上（CirculationResearch,），这一发现为探索LMNA基因突变导致DCM的机制提供了新的思路。

既然LMNA基因编码的A型核纤层蛋白参与调节LAD，故作者假设，DCM是由LMNA基因突变引发心肌细胞中LAD的重排，进而导致基因表达失调所致。为了验证这一假设，作者从5个正常人的心脏（对照组）和5个DCM患者的心脏（DCM组）中分离心肌细胞核，进行核纤层蛋白A的ChIP-seq来鉴定LAD。由于在人的结肠肿瘤细胞及衰老的人成纤维细胞中发现LAD与CpG位点的甲基化有关，表现为LAD整体的CpG位点低甲基化（Berman,），说明LAD的分布与基因组CpG位点的甲基化程度相关，但在人的心肌细胞中缺乏相关研究。因此作者又通过简并性亚硫酸氢盐测序（RRBS）和RNA-seq来分别描绘基因组LAD的甲基化图谱与基因表达谱，进行多组学数据联合分析，旨在研究DCM患者心肌中LAD与CpG甲基化修饰及基因表达的关联性，以探讨DCM是否与LAD重组导致的基因表达失调相关。

首先，作者将对照组心脏切片进行了免疫荧光染色（图4A,B），检测对照组的心肌细胞比例是否正常。统计得到对照组心肌细胞核占比约为28%（图4C），与预期的正常值相符（CirculationResearch,;Cell,）。流式细胞术分析发现DCM组心肌细胞核的比率低于对照组（图4D-F），这反映了DCM中由于发生了心肌细胞的凋亡、坏死等导致心肌细胞的减少。

图4（A）鉴定对照组心脏切片中的心肌细胞；用PCMI抗体标记心肌细胞核，ACTN2抗体标记心肌细胞中的结构蛋白；（B）对（A）图局部放大展示；（C）对照组心脏切片中PCMI阳性细胞的比例；（D）流式分选对照组与DCM组心脏中PCMI阳性的心肌细胞核；（E）流式分选得到的PCM1阳性核占核总数的比例；（F）每mg心肌组织中PCM1阳性核的数目。

为了研究人心肌细胞中LAD的分布特点，作者将对照组和DCM组的心肌细胞核进行核纤层蛋白A的ChIP-seq来鉴定LAD，发现人心肌细胞中的LAD覆盖了20％的基因组区域，并且主要位于异染色质中，而在启动子和活跃转录区域中较少。在对照组心肌细胞中鉴定出基因组范围内有±77个LAD，平均大小为2.1±1.5Mbp；在DCM组心肌细胞中鉴定出±40个LAD，平均大小为3.5±0.9Mbp（图5I-J）。有趣的是，相比于对照组，DCM组的LAD中增加了个基因组区域同时丢失了个基因组区域（图5M），即LMNA突变导致了人心肌细胞基因组中个区域发生了LAD的重排。综上，与对照组相比，DCM组中LAD的数目略有降低、平均长度略有增加，证实了LAD在DCM中发生了重新分布。

图5（H）ChIP-seq分析LAD的代表性图，截取16号染色体长臂的一段，展示LAD区与非LAD区的基因富集情况；（I）对照组与DCM组中LAD的平均数目统计；（J）对照组与DCM组中LAD的平均长度统计；（M）韦恩图展示对照组与DCM组的LAD中发生上调或下调的基因数。

为了探究DCM中发生差异表达的基因及表达失调的通路，作者进行了RNA-seq分析（图6A）。与对照组相比，DCM组中的编码基因有个表达上调，个表达下调。转录组差异表达基因分析得到DCM中TP53通路被明显激活（图6B）。

图6（A）DCM组与对照组心肌的差异表达基因热图；（B）DCM组失调的通路展示，红色为激活，蓝色为抑制，圆点越大表示该通路发生失调的基因数越多。

为了探究DCM中LAD重排是否与重排区域CpG位点的甲基化状态相关并影响了基因表达，作者分别进行了ChIP-seq与RRBS、ChIP-seq与RNA-seq的数据联合分析。发现与对照组相比，DCM组的CpG甲基化水平在总体上（包括LAD区）是增加的（图7A）。LAD丢失的区域倾向于基因表达的上调（图7B），该区域基因主要涉及细胞催化活性、细胞外基质组成和MTOR信号通路；而形成LAD的区域倾向于基因表达的抑制（图7C），该区域基因主要涉及线粒体功能、应激反应和细胞周期调节。因此在DCM中，观察到LAD的形成与所在位点CpG甲基化水平的增加和基因表达的抑制有关。对丢失/形成的LAD区内表达失调的基因进一步预测其启动子区的转录因子结合位点，鉴定出包含THAP1、NRF1、ZBT14、SP1和KLF12在内共32个转录因子结合位点，发现它们大多与细胞凋亡和代谢相关（图7D）。最后，多组学联合分析发现DCM中LAD的重排与CpG甲基化的改变及大量编码/非编码基因的表达失调相关，这些基因涉及细胞死亡、细胞周期和代谢调节（图7E）；这些基因的表达同时受CpG甲基化及LAD重排的影响，进一步分析预测其启动子区转录因子motif的富集情况，发现MBD2、NRF1、SP1和CTCFL等转录因子易与之结合（图7F）。

图7（A）DCM心肌细胞的LAD/非LAD中全基因组范围、启动子区、基因间区的甲基化水平；（B）DCM中LAD形成区的差异表达基因热图；（C）DCM中LAD丢失区的差异表达基因热图；（D）丢失/形成的LAD区内的表达失调的基因的启动子区转录因子motif预测；（E）LAD、CpG甲基化组、转录组的联合分析；（F）失调表达基因的启动子区转录因子motif预测。

综上所述，人心肌细胞中的LAD覆盖约20％的基因组，由数百个编码和非编码基因组成。LAD在LMNA基因突变导致DCM表型的心脏中发生了重新排布，与显著改变的CpG甲基化及基因表达相关，提示DCM与LAD重排导致的基因表达失调相关。该研究为探索LMNA基因突变导致DCM的机制提供了新的思路。相信未来通过进一步研究，将更加深入地了解LMNA基因突变促进LAD重排的分子机制，为DCM的治疗提供可能的临床干预手段。

参考文献

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